接下来路易丝犯了一个更大的错误。1521年，波旁公爵查理的妻子苏珊娜病故，之前他们的儿子也夭折了，1522年，波旁公爵的岳母，那位令人畏惧的安娜公主也去世。路易丝身为波旁家族的后人，趁机提出对波旁财产的要求。并向波旁公爵求婚，愿意通过婚姻来解决两人的遗产纷争。可波旁公爵对成为国王的继父并不感兴趣，断然拒绝。路易丝恼羞成怒之下，两人打起官司，法院冻结了波旁公爵的财产，虽然有利于波旁公爵的证据更多，但法院还是判波旁公爵败诉。转眼间，波旁公爵查理失去儿子、妻子、大部分财产、遭到逼婚，又察觉到国王对自己的嫉妒。失望之下，他与查理五世暗暗交往，后来阴谋败露，他叛逃到查理五世那里。这个曾经富个敌国的波旁公爵，此时穷困得只剩下宝剑和斗篷。

波旁公爵查理，从法国的最高统帅成为法国最大的对手。1524年，波旁公爵与查理五世的另两名将领佩斯卡拉、科隆纳对法国驻守的米兰发动进攻，在比亚格拉斯击败前来增援的法军。此战中，富有传奇色彩的“无可挑剔的无敌骑士”巴亚尔战死。当他奄奄一息时，查理•德•波旁见到他，深表怜惜，骑士回答道：“可怜悯的不是我，而是你，因为你是对你的君主和你的祖国作战。”

波旁公爵查理给法国带来的损失还不止这些。1525年3月，在意大利的帕维亚，波旁公爵率领的帝国大军击溃了法国，法国方面战死的有邦尼维特元帅，特雷维尔元帅，德•富瓦元帅、阿朗松公爵以及德意志雇佣军的统帅萨福克、洛林的弗朗索瓦等，被俘的更是不计其数，第一个便是国王弗朗索瓦一世，他也成了继路易九世、约翰二世、路易十一之后，第四个被俘的法国国王。此外被俘的还有纳瓦尔国王亨利•德•阿尔布雷、蒙莫朗西元帅等。当天，查理•德•波旁以胜利者的姿态，看望了被俘的国王弗朗索瓦，这让他无地自容。他给母亲路易丝的信中写道：“除荣誉及生命外，儿已一无所有。”

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